上期内容请点击链接：肿瘤免疫学-第12章：自然情况下以及治疗引起的免疫监视中癌细胞的免疫原性应激和死亡（上）。

钙网蛋白

钙网蛋白(CALR)是内质网(ER)管腔中含量最丰富的蛋白质。在ICD中，一部分CALR易位到质膜表面(并且另一部分 CALR也可能会分泌出去)。

CALR暴露的复杂机制与真核细胞起始因子-2α(eIF2α)在内质网应激反应中的磷酸化有关，内质网应激反应最终导致eIF2PK2(最为人所知的是PKR)和EIF2K3(最为人所知的是PERK)的激活和/或相应磷酸酶的抑制(由催化亚基pp1和调节亚基GADD34组成)。

在eIF2α磷酸化下游，半胱氨酸蛋白酶(尤其是caspase-8，CASP8)被激活，钙网蛋白通过内质网-高尔基体转运和可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体（SNARE）依赖性胞吐被运输到细胞表面，该胞吐涉及囊泡相关膜蛋白1（VAMP1）和突触体相关蛋白23（SNAP23）。

一旦出现在细胞表面，CALR就充当一个“eat-me”信号，可促进肿瘤相关抗原转移到树突状细胞，因为树突状细胞表达CALR受体即低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1，最著名的是CD91；Fig12.3)。

CALR可以被CD47局部拮抗，CD47在癌细胞上有组成性表达，可以起到“don’t eat me”信号的作用。

PERK、CASP8、CALR或SNAP23的下调以及caspases和内质网-高尔基体转运的药物抑制足以在体内和体外破坏ICD。

相反，在化疗的背景下，通过thapsigargin(激活PERK)或PP1抑制剂刺激eIF2α磷酸化可以刺激CALR暴露并增强体内的抗癌免疫反应。

将CALR暴露途径缺陷的癌细胞包被重组CALR蛋白(该蛋白可能通过其凝集素结构域和糖萼之间的相互作用结合到质膜表面)可修复缺陷的ICD。同样，在小鼠模型中，瘤内注射CALR可以增强化疗诱导的免疫反应，改善肿瘤的生长抑制。

有广泛的证据表明，在癌症患者体内，CALR的表达和暴露有助于体内抗癌免疫监视。

在急性髓系白血病(AML) 和非小细胞肺癌(NSCLC)中，细胞内CALR的低表达水平与细胞表面CALR的低表达以及eIF2α的磷酸化水平降低有关。

在AML中，CALR蛋白的低表达对化疗后的无进展和总生存期有负面影响，这与AML相关肿瘤抗原的T细胞介导的免疫反应差有关。

在NSCLC中，约15%的患者癌细胞中几乎检测不到CALR蛋白，这与预后不良、DC-LAMP⁺树突状细胞和CD8⁺T淋巴细胞浸润减少有关。

值得注意的是，在NSCLC预后方面，低CALR表达的预后重要性甚至超过了TNM分期，这意味着CALR^low 1期NSCLC患者的生存率比CALR^high 3期和4期患者差。

这些结论通过CALR蛋白的免疫组织化学检测在两个不同的NSCLC队列中得到了证实，此外在另外一个NSCLC队列中，通过检测CALR mRNA水平及其与反映CTL和树突状细胞存在的基因的相关性，也得到了一致的结果。

同样，在卵巢癌中，如果结合对激活的树突状细胞的分析，高水平的CALR mRNA表达对患者的生存表现出有利的影响。相反，CD47的高表达对多种不同肿瘤的预后有负面影响。

骨髓增生性肿瘤中已描述了CALR基因的突变，导致相应基因产物的错误定位，尽管这些突变对肿瘤免疫监视的确切影响仍不清楚。

无论如何，临床数据证实了CALR暴露途径对肿瘤生物学的重要性。

Fig 13.2 作为树突状细胞抗原摄取信号的钙网蛋白。在免疫原性细胞死亡(ICD)过程中，内质网(ER)应激介导的内质网伴侣钙网蛋白(CALR)暴露(或释放)到质膜表面，是树突状细胞抗原摄取的信号。CALR与树突状细胞(DC)上表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)受体的结合有助于肿瘤相关抗原向DC的转移。

HMGB1

高迁移率族蛋白1(HMGB1)是含量最丰富的非组蛋白染色质结合蛋白。

HMGB1通常只在细胞核内被发现，但可以在抑制组蛋白去乙酰化酶后转移到细胞质中。

此外，HMGB1通常是从坏死性凋亡或继发性坏死的细胞中释放出来的。在对蒽环类药物的反应中，在RIPK3或MLKL被敲除的小鼠癌细胞中，与其具有坏死能力的对照细胞相比，其对蒽环类药物的反应释放出更少的HMGB1。

小鼠体内移植瘤实验表明，化疗后HMGB1在体内会从癌细胞中释放出来。HMGB1被RNA干扰耗尽的癌细胞在体内不能触发ICD，并对化疗产生耐药性。同样，注射抗HMGB1抗体可在体内消除ICD诱导的化疗引起的抗癌免疫反应，从而促进了肿瘤的生长。这些结果支持了细胞外HMGB1在肿瘤免疫学中作为一种DAMP（危险相关分子模式）分子的作用。

HMGB1一旦出现在细胞外空间，就可以与核酸和细菌多糖等多种附加因子相互作用。HMGB1还与几种受体结合，包括toll样受体4(TLR4)，TLR4在包括树突状细胞在内的多种免疫细胞上表达，刺激细胞成熟和抗原呈递(Fig12.4)。从宿主免疫系统敲除TLR4或其适配蛋白MYD88，可消除ICD的感知，并消除蒽环类或奥沙利铂对肿瘤生长的抑制作用。这一缺陷与树突状细胞抗原提呈减少有关，可通过溶酶体抑制剂氯喹的治疗部分恢复。

在人类乳腺癌中，HMGB1表达降低与疾病进展和肿瘤增大有关。HMGB1表达降低是乳腺癌的一个负面预后特征，它与CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞减少、FOXP3⁺调节性T细胞和CD68⁺肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制群在肿瘤内的浸润有关。

此外，至少有两种类型的癌症TLR4功能等位基因的缺失会影响患者的预后，即(1)乳腺癌和(2)分别以蒽环类药物和奥沙利铂为基础的辅助化疗治疗的结直肠癌。这些发现强调了HMGB1/TLR4的相互作用对癌症患者生存和预后的重要性。

在HMGB1阴性癌症的情况下，人工供应合成的TLR4配体树突状亲和素，可以弥补HMGB1的缺陷，并恢复小鼠模型化疗引起的抗癌免疫反应。这种方法是否也适用于携带HMGB1阴性肿瘤的癌症患者还有待研究。

Fig 12.4 HMGB1促进树突状细胞提呈抗原。高迁移率族蛋白1(HMGB1)通常隐藏在细胞核中，在免疫原性细胞死亡的后期阶段被释放出来，作为对蒽环类药物化疗或电离辐射等治疗的反应。细胞外HMGB1作为树突状细胞(DC)上TLR4的配体，触发MYD88依赖信号，刺激DC成熟并向细胞毒性T细胞(CTL)呈递抗原。TLR4,Toll样受体4。

I型干扰素与趋化因子

作为对化疗药物的反应，肿瘤细胞会释放包括DNA和双链RNA在内的核酸，这可能会激活细胞内或细胞外对这类异常分子的传感器。这种核酸传感器的一个例子是Toll样受体3(TLR3)，但是包括GAS/STING 途径在内的其他传感器也可能参与其中。这些刺激类似于由病毒感染引起的刺激，因此可以被称为“病毒拟态”，癌细胞转录激活一个或几个 I 型干扰素基因，分泌相应的基因产物，然后刺激它们的I型干扰素受体(IFNAR)，诱导多方面的I型干扰素反应，包括激活多种抗病毒和免疫刺激基因产物 （Fig12.5）。

一种典型的抗病毒基因产物是粘液病毒抗性1 (MX1)，一个众所周知的免疫刺激基因产物是C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)，它作用于C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)，吸引T淋巴细胞进入肿瘤床。缺乏 TLR3、IFNAR 或 CXCL10 的癌细胞在化疗后无法引发抗癌免疫反应，因此对治疗无效。局部注射重组 I 型干扰素和 CXCL10 可以弥补这一缺陷，这强调了 I 型干扰素反应对小鼠肿瘤模型治疗结果的重要性。

至少在乳腺癌患者中，上述途径似乎与治疗相关。化疗可诱导MX1在体内表达。信号转导和转录激活因子 1 (STAT1) 磷酸化或低 MX1 表达的缺乏表明通过 IFNAR 信号传导的缺失构成不良预后特征，特别是在基于蒽环类的辅助化疗的情况下。

据报道，影响TLR3功能的多态性会影响乳腺癌患者的命运。这些结果必须在越来越多的临床证据的背景下解释，还有证据表明，I型干扰素可以注射到患者体内，以刺激肾癌和慢性粒细胞白血病(CML)患者的抗癌免疫反应。

Fig 12.5 I型干扰素依赖性趋化因子的释放会触发T细胞启动。作为对模拟病毒感染的化疗药物的反应，死亡细胞中会释放核酸，成为Toll样受体3(TLR3)等分子的传感器，并在转录上激活一个或几个1型干扰素基因。一旦分泌，干扰素刺激I型干扰素受体诱导多方面的I型干扰素反应，包括产生C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)，作用于C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)，吸引T淋巴细胞进入肿瘤床，最终导致γδT细胞介导的αβT细胞启动。CXCR3，CXC趋化因子受体3；IFNAR1；干扰素α/β受体亚基1；IL，白细胞介素。

结束语和展望

综上所述，有多种 DAMP（如 ANXA1、ATP、CALR、HMGB1 和 I 型干扰素）在免疫原性化学疗法中充当辅助信号（Fig12.6）。

要注意地是，这些DAMP分子并不以冗余的方式起作用(在冗余的情况下，它们将能够相互替代)，而是以非冗余的方式起作用，这意味着从系统中移除一个单一的DAMP(或其受体)就足以破坏免疫原性化疗引起的抗癌免疫监视。

产生这个问题的一种可能性是假设每个 DAMP 都必须遵循设定好的时空序列，很可能是在一个狭窄的强度范围内，遵循“钥匙-锁原则”。即只有当 DAMP 以正确的顺序、以正确的强度表达时，它们才能成为打开通常阻止免疫反应的保险库的“钥匙”。

据推测，该系统的这种特殊情况可能是为了降低正常组织中不必要的自身炎症和自身免疫反应的可能性。另一方面，这意味着由于一个单一的DAMP受体的突变(可能是由免疫选择驱动的)或抑制，或者直接抑制一个单一的DAMP足以破坏抗癌免疫监视，并减少癌症患者在化疗时控制疾病的机会。

抛开这些猜测，我们可以通过检测暴露于抗癌试剂的癌细胞对于所有已知的DAMPs的释放来确定哪些是较好的ICD诱导剂。

实际上，这是通过构建生物传感器细胞系来实现的，这些细胞系表达与绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物融合的ANXA1、CALR或HMGB1的荧光蛋白。通过将GFP置于MX1启动子的控制下，可以确定I型干扰素反应的激活。因此，使用这种生物传感器，可以选择刺激ICD各个方面的抗癌药物。我们已经成功地使用这一方法在小鼠模型中鉴定出了在体内能够有效刺激抗癌免疫反应的ICD诱导剂。

我们很容易推测，这种方法在根据 ICD 刺激潜力选择成功的抗癌药物方面可能会变得更加有用。显然，这种方法需要在临床前模型中进行额外的体内实验，同时应避免使用像过去那样携带异种移植物的免疫缺陷小鼠（参见本章第一节）。相反，抗癌候选药物应该始终在具有免疫活性的啮齿动物模型中进行评估，包括人源化小鼠模型。我们预测，这种方法将大大降低传统药物开发过程中的损耗率。  

Fig 12.6 治疗诱导的免疫监视中免疫原性细胞死亡的机制。癌细胞在阿霉素或奥沙利铂等化疗药治疗后发生免疫原性细胞死亡(ICD)，表现或释放某些危险相关的分子模式(DAMP)，如钙网蛋白(CALR)、ATP、I型干扰素(IFN)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和膜联蛋白A1(ANXA1)。这些分子与骨髓或淋巴细胞表面的识别受体的连接可促进树突状细胞的招募和激活，它们回到垂死的癌细胞，随后对肿瘤抗原摄取，最后进行呈递(在树突状细胞成熟时)。免疫刺激性细胞因子的产生最终导致涉及αβ和γδT细胞的适应性免疫反应的开始，从而重建癌症免疫监视。

本公众号上的往期文章同步发布至对应网站OncoLab实验室。

网站自带检索功能，可以根据关键词进行检索，并且可以根据日期及内容分类进行查看 ,大家可以收藏方便在电脑上查看。

网址是：oncolab.cn

▉  OncoLab学术导航

此外，梳理了一下这几年攒的收藏夹，做了一个导航网页，包含常用网站、文献阅读、试剂订购、基金相关、实用工具、常用数据库等分类内容，并且整合了百度、谷歌、必应三大搜索引擎到检索工具中，欢迎收藏或设置为主页使用~

网址是：dh.oncolab.cn

▉  OncoLab知识星球