胶质母细胞瘤(GBMs)具有高度的颅内侵袭性，且对免疫治疗有抵抗性。在最近的一项1期临床试验中，研究者在复发性3级和4级恶性胶质瘤患者中评估了D2C7(一种由假单胞菌外毒素和GBM中靶向野生型EGFR (EGFRwt)和突变型EGFR变异体ⅲ(EGFRvIII)蛋白的重组抗体片段构成的免疫毒素)。虽然在一小部分患者中观察到令人鼓舞的生存结果和放射学缓解，但疗效有限。为了探索改善临床应答的途径，Parker等评估了使用激动型抗CD40(ɑCD40)增强抗肿瘤免疫的可能性。

D2C7通过传导增强方式(CED)给药，即将导管插入肿瘤组织以改善药物分布。为了以同样的方式递送(ɑCD40)， Parker等开展了一项剂量探索研究，确定100μg αCD40是有效剂量，并且毒性较低。在CT-VIII胶质瘤模型中，该剂量用于进一步比较D2C7或αCD40b单独治疗以及联合治疗的研究。在这种情况下，与任一单药治疗相比，联合治疗引起了更多小鼠的肿瘤消退，降低了肿瘤负荷，并延长了生存期。完全排斥肿瘤的小鼠也可抵抗不表达dmEGFFRvIII的亲代CT-2A细胞的再攻击，这提示产生了免疫记忆和抗原表位扩散。在GL-VIII胶质瘤模型、含有CT-VIII(抗原阳性)和亲本CT-2A(抗原阴性)肿瘤细胞混合的异质性肿瘤模型以及脑实质转移/肿瘤细胞浸润模型中，我们观察到了类似的结果。在亲代CT-2A肿瘤模型中，研究人员还证实，D2C7的作用依赖于dmEGFRvIII靶点的存在。此外，在评估αCD40给药途径的实验中，与全身给药相比，CED共输注方式对存活人数和生存时间的影响最强，表明了这种给药方式对D2C7和αCD40的疗效。

Parker等利用流式细胞术和免疫组化评估了D2C7和αCD40对免疫应答的影响，发现在治疗后6 d, D2C7治疗(单药和联合治疗)增加了中性粒细胞和小胶质细胞，减少了NK和巨噬细胞。同时，αCD40(单药和联合治疗)对这些细胞群的大小影响很小，但诱导了小胶质细胞(CD80和MHC-II增加)和巨噬细胞(CD68增加)的活化。在联合治疗组中，巨噬细胞也产生了较多的TNFα，并且表达较少的抗炎标志物CD206，这表明巨噬细胞向促炎表型转变。

接下来研究T细胞反应，研究人员发现联合治疗增加了CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞的数量，其中D2C7对CD4+ T细胞的增加贡献更大，而αCD40对CD8+ T细胞的增加贡献更大。此外，CD8+ T细胞清除实验表明，联合治疗和长期免疫保护的全部抗肿瘤效应依赖于CD8+ T细胞，而不是CD4+ T细胞或B细胞，因此在这些模型中，CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫的主要介质。在肿瘤中，大多数CD8+ T细胞表现出效应记忆表型，在αCD40组和联合治疗组中尤其明显。联合治疗组具有早期活化/耗竭表型的CD8+ T细胞比例最高，而终末期耗竭表型的CD8+ T细胞比例最低。研究人员观察了耗竭的CD8+ T细胞(Tex)的活化潜能，发现在αCD40和联合治疗的小鼠肿瘤中含有较高频率的可被抗PD-1激活的祖细胞样耗竭的Tex，以及较低频率的终末耗竭的Tex，这表明这些治疗限制了T细胞耗竭，并维持CD8+ TILs处于更活跃的Tex祖细胞状态。

为了确定肿瘤内和外周CD8+ T细胞的作用，Parker等人在治疗前不久使用FTY720阻断了T细胞从淋巴结流出。这对接受联合治疗的小鼠影响很小，提示抗肿瘤免疫主要是由肿瘤中已经存在的CD8+ T细胞介导的。此外，无论是否接受FTY720治疗，在联合治疗的小鼠中，脑内CD8+ TILs的频率均增加，这表明T细胞的增加是由于局部扩增和自我更新，而不是来自新的淋巴结来源的外周细胞的流入。与此相一致的是，Ki67+CD8+ TILs也是增加的。

在缺乏cDC1s的Batf3−/−敲除小鼠中，CD40的作用消失，D2C7和联合治疗对长期生存的影响弱于野生型小鼠。Batf3基因敲除也限制了联合治疗促进祖细胞样CD8+ TILs的能力，因为这些小鼠中的大多数TILs最终被耗尽。

Parker等通过分析RNAseq数据来评估治疗引起的基因表达变化，他们推断αCD40主要介导免疫效应，如T细胞运输、免疫应答、细胞因子信号传导和Th1应答。D2C7主要参与细胞凋亡、细胞内运动、趋化和炎症反应等多种功能。D2C7组和联合组还与模式识别受体通路、细胞衰老死亡、肿瘤生长抑制和CD40上调相关。总体而言，D2C7和αCD40调控的基因之间的重叠很少，显示了不同的作用机制，D2C7介导肿瘤细胞杀伤和促进炎症，从而支持αCD40诱导的抗肿瘤免疫应答。

此外，联合治疗后更多的CD8+ TILs是多功能的，在αCD40治疗和联合治疗后均观察到肿瘤抗原特异性T细胞的显著增加。αCD40诱导的多功能T细胞主要分泌效应性和趋化性细胞因子，而D2C7和联合处理诱导的多功能T细胞分泌的细胞因子更广泛，包括刺激性、调节性和炎性细胞因子。不同的处理方式也诱导了能够分泌颗粒酶B、IFNγ和MIP-1α的特异性T细胞亚群。

总之，这些结果表明，在表达EGFR的小鼠胶质瘤中，D2C7和αCD40通过互补的机制共同促进促炎免疫微环境的形成并支持抗肿瘤免疫应答。Parker等也发现了人GBM标本中CD40的高表达，尤其是内皮细胞和坏死区域周围，这进一步支持在临床情况下在D2C7方案中添加αCD40。一项在复发性恶性胶质瘤患者中使用CED给药方法进行的含人激动型CD40抗体的D2C7-IT疗法的1期临床试验已经开始。