为了揭示为什么抗PD-1疗法在大多数黑色素瘤中失效，Neubert等人研究了集落刺激因子1（CSF1）在形成促肿瘤、富含巨噬细胞的微环境中的作用。CSF1是单核细胞和巨噬细胞的重要调节因子，控制着巨噬细胞从前体细胞中的增殖和存活。发表在《科学转化医学》上的实验结果表明，CSF1表达的影响及其在限制免疫检查点阻断疗法有效性方面的作用，主要是通过增强M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的功能和累积。

Neubert等人首先观察到，黑色素瘤患者外周血中的CSF1水平高于健康志愿者，且IV期患者高于IIIB期患者。为了揭示CSF1与黑色素瘤细胞之间的直接关系，研究人员在体外对四个低传代次数的黑色素瘤细胞系进行了CSF1产生的测试。任何一个黑色素瘤细胞系的条件培养基都显示出没有或低水平的CSF1表达，然而，在将细胞系与MelanA特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞（CTL）克隆共培养后，每个细胞系的条件培养基中都能检测到CSF1。此外，在遇到黑色素瘤特异性CTLs时，黑色素瘤细胞内的CSF1表达增加，而非黑色素瘤特异性CTLs并未导致细胞系分泌CSF1。对八个人类黑色素瘤标本的染色研究表明，约80%的黑色素瘤细胞表达CSF1，这与高CD8+ T细胞密度的区域相关。

刺激作用不依赖CTLs与黑色素瘤细胞之间的直接细胞接触，进一步实验确定，能够诱导黑色素瘤细胞中CSF1表达的是CTLs来源的可溶性因子TNFα和IFNγ。每种细胞因子都能单独诱导CSF1表达，它们的组合在所有15个测试的细胞系中都能显著增加CSF1表达，T细胞释放的IFNγ的峰值浓度与细胞上清中CSF1表达的开始相关。基于这些体外研究，TNFα和IFNγ被认为是能够诱导黑色素瘤细胞系中CSF1表达的CTL来源的因子。研究团队接着利用来自癌症基因组图谱（TCGA）的大量人类转移性黑色素瘤患者信息，证明了CSF1、IFNγ和TNFα之间的表达水平相关。

TCGA数据还用于检查CD8+ T细胞和TAM水平与抗PD-1疗法反应性之间的关系。对预处理的肿瘤活检样品进行表达分析，将其标记为应答者或非应答者，结果表明，非应答者在高数量的CD8+ T细胞和CSF1+、CSF1R+和CD163表达之间存在很强的关联。这些结果使研究团队得出结论：CD8+ T细胞存在于人类黑色素瘤中，诱导了由CSF1驱动的TAMs浸润，而CSF1是在接触CTL细胞因子后由黑色素瘤细胞产生的，这表明这一级联事件限制了抗肿瘤反应。研究团队发现CD8A/CSF1R的高比例，表明TAM浸润尚不严重，是预示整体生存改善的指标。

接下来，研究人员通过小鼠模型来证明CSF1的重要性，以“反向验证”在人体中观察到的结果。研究人员监测了BRAFV600E突变卵清蛋白表达的SM1细胞（SM1-OVA），它们分泌高水平的CSF1并产生高度巨噬细胞浸润的肿瘤，观察了单一抗PD-1或抗CSF1R治疗以及联合治疗对肿瘤生长抑制的影响。联合治疗效果最好，在17天的治疗后，所有肿瘤完全消退，小鼠脾脏中的CD4+和CD8+ T细胞数量增加。第二个模型Yummer1.7更接近人类黑色素瘤的高突变负荷，研究发现抗CSF1R和抗PD-1治疗的组合消除了它们的大部分肿瘤，显著延长了治疗后小鼠的生存期。在第三个转基因模型iBIP2中，由于抗CSF1R抗体无法消除/重新极化TAMs，联合治疗无法抑制黑色素瘤的进展。有趣的是，iBIP2中多种髓系细胞的浸润明显高于SM1-OVA肿瘤；表达分析表明，趋化因子Ccl2和Cxcl12以及细胞因子IL-4基因的高表达，这可能抵消了单一或联合治疗的影响。

Neubert等人的研究成果展示了CSF1在转移性黑色素瘤中的重要性，无论是体外还是体内。抗CSF1R联合抗PD-1显著改善了三种小鼠模型中两种的肿瘤消退和总体生存，表明它在临床试验中具有潜在应用价值。作者表示，他们打算在肿瘤微环境中M2型TAMs丰富的黑色素瘤中使用抗PD-1/PD-L1和CSF1R抑制剂。