上期内容：肿瘤免疫学-第27章：肠道菌群对癌症治疗反应的影响（下）

28.1 引言

利用免疫刺激来根治癌症并不是一个新概念。早在19世纪中叶，德国内科医生W. Busch就观察到，一名感染化脓性链球菌的患者在患上严重的丹毒后，其癌症显著消退。这一发现促使威廉·科利博士将化脓性链球菌提取物注射到癌症患者体内，这种方法后来被称为“科利毒素”。科利博士和其他人对此方法取得了不同程度的成功。虽然这种疗法随着放射治疗的引入逐渐失宠，但基于这些发现的较新实验表明，内毒素可以诱导显著的免疫反应。早期试验显示了一些临床反应，但由于毒性较高，这种方法一度被搁置。然而，这些反应证明了用强烈的促炎刺激激活抗肿瘤免疫反应的可能性。

在过去十年里，癌症免疫治疗取得了显著进展。针对CTLA-4和PD-1/PD-L1免疫检查点的多种单克隆抗体已获批准，许多其他免疫检查点的小分子和单克隆抗体也在临床试验中取得了快速进展。这些疗法依赖于重新激活被肿瘤微环境中的免疫抑制机制所沉默的抗肿瘤免疫反应。因此，不出所料，最显著的临床反应出现在高免疫原性肿瘤中，这些肿瘤具有较高的突变负担和一些可能的新抗原，例如吸烟者的黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)。此外，在具有固有免疫浸润性的肿瘤中，例如霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的一些亚型，通过肿瘤细胞上PD-L1的高表达，也观察到显著的临床反应。

尽管如此，对于大多数已获批使用检查点抑制剂治疗的实体癌症患者（如肺癌、膀胱癌、肾细胞癌和黑色素瘤），由于肿瘤微环境中过强的免疫抑制或免疫反应太弱，难以产生全身性免疫反应和显著的肿瘤消退。支持这一理论的证据表明，许多实体肿瘤的“炎症”表型和显著的免疫细胞浸润程度预测了对免疫治疗的反应。这些发现提示，在肿瘤微环境中诱导炎症的同时，结合抑制检查点的方法，将增强对肿瘤抗原的免疫反应，并提高临床应答率。

CTLA-4和PD-1阻滞剂的疗效，特别是在联合使用时，明确显示了其成功的潜力。然而，这些双重疗法具有显著的毒性，并且目前仅在高免疫原性肿瘤中达到接近50%的应答率。为提高疗效与降低毒性，正在研究大量替代组合方法。其中一个有前景的类别是疫苗接种，这类似于传统疫苗，通过在肿瘤相关抗原（TAA）的基础上引入免疫佐剂，将免疫反应集中在癌症特异性靶点上。

许多体外方法已经显示出有效性，这些方法依赖于抗原提呈细胞（APC）与特定的TAA或整个肿瘤裂解物的体外分化，或者依赖于对TAA有反应的肿瘤浸润性淋巴细胞的体外扩增。尽管这些体外方法的小规模研究显示了强大的临床反应，但由于其资源密集型的特性，难以优化和大规模应用。

一种替代方法是原位疫苗接种（ISV），即在肿瘤内创建一种“疫苗”，以实现与体外技术相同的目标。具体来说，这些疗法旨在通过对癌细胞的损伤，随后摄取和处理释放的肿瘤抗原和刺激性“损伤”相关分子，最终将抗原呈递（及交叉呈递）给CD4和CD8 T细胞(Fig 28.1)。

治疗ISV的方法有多种，但其一般原理是相同的，特别是：(1)诱导免疫原性细胞死亡；(2)白细胞重新聚集，诱导免疫治疗反应的“炎症”表型；(3)激活APC，导致固有淋巴细胞的激活和TAA呈递给抗原特异性效应细胞；以及(4)调节或消除免疫抑制的肿瘤微环境。在这里，我们回顾了实现这四个目标的一些方法。

Fig 28.1 诱导肿瘤抗原原位免疫反应的核心机制。首先，通过刺激引起免疫原性细胞死亡。这一过程导致驻留或被招募的抗原提呈细胞（APC）吸收抗原，并在促炎信号的作用下被激活。促炎信号既源自先天免疫反应，又有助于抗原的处理和呈递/交叉呈递，从而引发适应性免疫反应。

28.2 免疫原性细胞死亡

免疫原性细胞死亡（ICD）导致肿瘤抗原从死亡细胞中释放到微环境中，并伴随着激活抗原提呈细胞（APC）的细胞应激信号和损伤相关分子模式（DAMP）。与细胞凋亡的免疫耐受不同，ICD不仅提供抗原，还提供炎症刺激。因此，诱导这种形式细胞死亡的药物有时能够自行引发疫苗反应。

尽管免疫疗法通常被描述为具有不同的机制，但实际上，许多在上个世纪使用的细胞毒性疗法可能已经包含了免疫刺激成分。对免疫系统在癌症中的作用的早期观察包括非范围效应，即给予患者局部放射治疗导致远离辐射区域的疾病消退。虽然这种现象罕见，但提供了进一步优化的原理依据。由于辐射能够诱导ICD，因此已被用于各种疫苗/免疫治疗方案中。

辐射会刺激钙网蛋白转位到细胞表面，并释放大量的潮湿物质，包括游离DNA、高迁移率族蛋白1（HMGB1）和ATP。这些信号刺激树突状细胞（DC）上的促炎受体，激活炎症体和Toll样受体（TLR）途径以及其他模式识别受体（PRRs）。当死亡或濒临死亡的肿瘤细胞被吞噬细胞摄取时，无细胞DNA还能激活干扰素基因刺激物（STING）途径，诱导干扰素的产生，并增强强效T细胞的激活。同时，辐射进一步诱导关键趋化因子的表达，包括CXCL9、CXCL10和CXCL16，这些趋化因子对于效应CD8+ T细胞在受照射肿瘤中的募集至关重要。

然而，辐射也被证明能够通过募集和分化调节性T细胞和髓源性抑制细胞（MDSC）到肿瘤微环境中来抑制免疫反应。这会导致细胞因子如转化生长因子-β的分泌，并通过CD39和CD73将免疫原性ATP转化为腺苷，从而通过A2a腺苷受体抑制T效应细胞的激活和存活。

研究人员已经证明，肿瘤内的T细胞和肿瘤细胞在接受电离辐射后，PD-1和PD-L1的表达显著上调。虽然这些和其他抑制性配体也是T细胞激活的标志，但T细胞在激活时上调这些配体和受体，作为对免疫系统的生理检查以避免自身免疫。这可能解释了临床上相关的非范围效应的罕见性，并为使用放射治疗的组合方法提供了合理的靶点。许多临床前研究表明，放射治疗（RT）与检查点阻断疗法具有协同作用，尽管临床成功有限。到目前为止，大多数研究集中在CTLA-4上，但也有令人鼓舞的临床前研究将放射与PD-1和其他关键检查点及免疫抑制途径的阻断相结合（Kang等人广泛回顾了这些研究）。

此外，辐射对淋巴细胞具有高度毒性，因此继续用于一些淋巴细胞性白血病的干细胞移植调节方案。根据剂量和治疗范围的不同，RT可能会消除旨在激活的T细胞。这支持使用有限的视野和分级剂量以达到最佳的疫苗效果；临床前模型支持分级剂量在优化抗肿瘤免疫反应方面的益处。在这一领域的领导者Formenti教授和Demaria教授在本系列中提供了关于辐射作为新兴免疫疗法的佐剂的全面回顾。

虽然放疗和化疗通常都被认为是淋巴毒性的，但化疗也可以作为免疫治疗的佐剂发挥多重作用。像放射一样，化疗会导致ICD，释放免疫原性配体和肿瘤抗原，这些抗原可以被肿瘤内的APC及周围组织和引流淋巴结摄取。Kepp等人广泛回顾了这一点。除了肿瘤细胞毒性，淋巴毒性化疗，如环磷酰胺，已被发现优先耗尽调节性T细胞（Tregs），对T效应细胞的影响较小。

免疫原性细胞死亡方面的权威Kroemer教授在本系列的其他部分回顾了化疗在启动免疫反应的初始步骤中的作用，以及新旧细胞毒性化疗与新兴免疫疗法结合所起的作用。

28.3 免疫细胞的招募

虽然免疫原性细胞死亡可能是启动和增强肿瘤特异性免疫反应的必要步骤，但观察到这种异常效应的情况较少，而且很少有研究表明放疗或化疗能够增加肿瘤特异性T细胞的数量。这表明需要额外的信号来增强抗肿瘤抗原（TAA）的免疫反应。为促进抗原的摄取，一种常用的方法是添加生长因子以诱导抗原提呈细胞（APC）的分化和重新聚集到肿瘤组织中。与全身注射细胞因子相比，直接瘤内注射细胞因子和生长因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3L），显示出在增强免疫治疗反应方面的前景。

临床前研究在小鼠黑色素瘤模型中，通过转导具有相应基因的肿瘤，评估了多种细胞因子和生长因子的免疫刺激能力。这些研究考察了一系列基因，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、干扰素γ、IL-1RA、ICAM、CD2、肿瘤坏死因子-α和GM-CSF。其中，GM-CSF表现出最显著的肿瘤排斥反应，并诱导了肿瘤特异性的CD4+和CD8+ T细胞，从而保护小鼠免受未转导黑色素瘤细胞的再次攻击。GM-CSF是一种造血生长因子，可由淋巴细胞、髓系细胞以及肿瘤微环境中的成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞产生，能够激活天然和获得性免疫反应。其表达通常由炎性细胞因子如IL-6和肿瘤坏死因子-α促进，而免疫抑制细胞因子如IL-10则降低其表达。

临床上，21名黑色素瘤患者的自体肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF，随后的肿瘤活检显示大多数患者有更多的T细胞浸润，以及肿瘤坏死、纤维化和水肿。类似的免疫反应在对黑色素瘤、肺癌和前列腺癌患者的自体GM-CSF转导肿瘤细胞的试验中也有所观察。GM-CSF与促进免疫原性细胞死亡的治疗相结合，也显示了诱导抗肿瘤免疫的作用。一项滤泡性淋巴瘤的原位疫苗（ISV）试验结合了局部放疗和瘤内注射未成熟的自体树突状细胞和GM-CSF，结果显示36%的总有效率（ORR），其中那些有可测量的肿瘤导向CD8+反应的患者有最显著和持久的临床反应。

虽然DC的吸引和成熟导致了促炎免疫信号，但肿瘤内的GM-CSF也被发现对中性粒细胞和其他髓系细胞具有趋化作用，能够促进血管生成和抑制CD8+ T细胞的启动。此外，GM-CSF通过增强基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，直接促进某些肿瘤的生长。这些蛋白酶有助于肿瘤的生长、迁移和转移。

一些人类和小鼠癌症被发现会表达GM-CSF或G-CSF及其各自的受体，导致自分泌促进增殖。一些研究表明，GM-CSF的作用可能因所涉及的组织而异，因此在某些癌症中它可能作为免疫佐剂使用，而在其他癌症中则可能促进肿瘤生长并抑制免疫反应。大量人类结直肠癌基因阵列表明，超过三分之一的癌症产生GM-CSF，而且血清中GM-CSF水平升高的结直肠癌患者预后较差。在头颈癌中，血清中GM-CSF和其他生长因子与较差的侵袭和预后相关；类似地，浸润性膀胱癌偶尔会分泌GM-CSF，一些患者的癌细胞也表达GM-CSF受体，这些都与较差的预后相关。白细胞增多和血液或肿瘤样本中GM-CSF水平升高也见于各种其他癌症，包括肺癌和多形性胶质母细胞瘤，这些癌症也是加入GM-CSF的免疫治疗试验的靶点。这些数据提示需要考虑能够分化或招募APC到肿瘤部位的替代生长因子。

Flt3L是一种造血生长因子，对干细胞和祖细胞的动员和分化至关重要。Flt3L已被证明促进DC和NK细胞从造血干细胞前体细胞分化。特别是，Flt3L直接诱导部分CD34+CD45RA-早期祖细胞分化为DC前体，并增加浆细胞样树突状细胞（PDC）和CD141+和CD1c+（CDC）数量。这些DC亚群，特别是CD141+亚群，能够将肿瘤抗原交叉呈现给CD8+ T细胞，并且它们在肿瘤内的存在与临床结果密切相关。

许多临床前研究已经证明了Flt3L动员免疫细胞亚群的能力，其中DC占主导地位，包括显示Flt3L在黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和肝细胞癌中的抗肿瘤作用的模型。其他模型已经证明，单用Flt3L无效，而最佳的抗肿瘤免疫反应需要诱导抗原释放和APC刺激的组合方法。例如，在乳腺腺癌的小鼠模型中，Flt3L预激增强了低剂量辐射引起的非范围效应，以T细胞依赖的方式消除了全身肿瘤负担，而Flt3L单独使用无效。

临床上，一项I期研究评估了自体DC的使用，首先用Flt3L在体内扩增，然后体外装载癌胚抗原肽，再输注。治疗耐受性良好，证明Flt3L扩增的DC是原来的20倍，12名患者中有2名肿瘤显著消退。临床反应与CD8+ CEA四聚体+ T细胞的扩增相关，证实了CD8+ T细胞在该治疗策略中的作用。在腹膜癌、间皮瘤和前列腺癌的其他早期试验中，肿瘤内和全身树突状细胞也有类似的显著增加，且毒性有限。这些早期试验表明，Flt3L能够显著增加肿瘤内APC的存在和活性，且类似于GM-CSF，联合治疗对于启动临床缓解是必要的。

尽管Flt3L治疗促进了DC的系统产生和肿瘤内的渗透，但这些DC是不成熟的DC，缺乏激活效应细胞所需的共刺激分子。这既限制了它们促进效应T细胞反应的能力，又实际上促进了耐受途径，使肿瘤特异性T细胞保持静止。因此，虽然Flt3L能够增加肿瘤内DC的数量，但额外的促炎刺激是必要的，以在到达时激活这些APC。