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Cell：SMARCAL1是促进肿瘤免疫逃逸的天然免疫信号和PD-L1表达的双重调节器

杂志名称：Cancer Cell

发表日期：2024.03.01

DOI：10.1016/j.ccell.2024.02.013.

PubMed：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38490213/

影响因子：50.3

主要组织相容性复合体（MHC）I类抗原呈递缺陷是癌症免疫逃逸的常见机制，但对其机制和解决这一挑战的潜在策略仍然了解不足。通过β2-微球蛋白（B2M）缺陷的小鼠肿瘤模型，研究者发现MHC I类缺失导致肿瘤微环境（TME）的大量免疫荒漠化以及对免疫、化疗和放疗的广泛抵抗。该研究还展示了通过mRNA技术编码持久性IL-2进行治疗可以恢复免疫细胞浸润、IFNγ促进的高度炎症的TME特征，并且当与针对肿瘤的单克隆抗体（mAB）联合使用时，可以克服治疗抗性。意外的是，这种治疗的有效性是由释放IFNγ的CD8⁺ T细胞驱动的，这些细胞识别由TME中活化的巨噬细胞交叉呈递的新抗原。在IL-2治疗下，这些巨噬细胞获得了增强的抗原呈递能力和其他M1表型相关特征。该研究的发现强调了在治疗MHC I类缺陷癌症中恢复新抗原特异性免疫应答的重要性。

这篇文章的核心创新性在于揭示了一种新的癌症治疗策略，即通过mRNA技术编码的长效IL-2来恢复MHC I类分子缺陷癌症中针对新抗原的CD8⁺ T细胞免疫反应。文章研究了β2-微球蛋白（B2M）缺失的小鼠肿瘤模型，发现MHC I类分子的缺失导致肿瘤微环境（TME）的免疫荒漠化和对免疫、化疗和放疗的广泛抵抗。

文章展示了长效mRNA编码的IL-2治疗能够恢复TME中的免疫细胞浸润、促进IFNγ驱动的高度炎症反应，并且当与针对肿瘤的单克隆抗体联合使用时，能够克服治疗抵抗。意外的发现是，这种治疗的有效性由能够识别由TME内活化的巨噬细胞跨呈递的新抗原的IFNγ释放CD8⁺ T细胞驱动。这些巨噬细胞在IL-2治疗下获得了增强的抗原呈递能力和其他M1表型相关的特征。

研究的意义在于强调了在治疗MHC I类缺陷癌症时，恢复针对新抗原的特异性免疫应答的重要性。这为克服癌症免疫逃逸机制提供了新的策略，并可能为MHC I类分子缺陷癌症的治疗开辟新的途径。

图1：MHC I类缺失肿瘤的免疫荒漠化

(A) 通过流式细胞术确定CT26或CT26-B2m^-/-肿瘤中T细胞和NK细胞渗透的时间动态（每个时间点n = 4-5）。

(B) 通过流式细胞术，在接种后20天内确定CT26、MC38或B16F10野生型（WT）和B2m^-/-肿瘤中免疫细胞的渗透情况（n = 8）。

(C) 通过αCD8免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）染色以及Ncr1原位杂交（ISH），在接种19天后确定CT26或MC38 WT和B2m^-/-肿瘤中CD8⁺ T细胞和NK细胞的渗透（展示了代表性示例；每行代表一个单独的肿瘤）。比例尺=100 mm（IF）或50 mm（IHC, Ncr1 ISH）。

(D) CT26、MC38或B16F10 WT和B2m^-/-细胞在体内的生长（n = 5）。

(E) 通过流式细胞术，在接种后20天内确定渗透CT26或MC38 WT和B2m^-/-肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的PD-1表达（n = 8）。

(F) 通过定量实时PCR（qRT-PCR），在接种后19天内确定CT26（n = 3）或MC38（n = 5）WT和B2m^-/-肿瘤组织中所示基因的表达。

(G) 通过流式细胞术，在接种后20天内确定CT26或MC38 WT和B2m^-/-肿瘤细胞中PD-L1的表达（n = 8）。

(H) 通过流式细胞术，在接种后20天内确定渗透CT26或MC38 WT和B2m^-/-肿瘤的巨噬细胞中PD-L1和MHC II类的表达（n = 8）。

以均值作为汇总统计。误差条表示均值的标准误差（SEM）。通过Grubb’s检验移除了单个异常值（B）。通过两种方式ANOVA与Sidak’s事后检验（A, D）或学生的双尾非配对t检验（B, E, F, G, H）确定统计显著性。ns，不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S1。

图2：MHC I类缺失肿瘤的治疗抵抗性

(A–F) 在接受以下治疗后，携带所示亲本或B2m^-/-肿瘤变异体的小鼠的存活情况：αPD-1/αCTLA4组合治疗或同种型对照（A；n = 10）、αPD-1、αCTLA4或不相关对照单克隆抗体（B；n = 10）、编码gp70的mRNA-LPX疫苗或空载体mRNA-LPX作为对照（C；n = 10）、奥沙利铂（OX）/氟尿嘧啶（5-FU）双药治疗或车辆对照（D；n = 9–10）、OX或车辆对照（E；n = 10–15）、局部放疗（LRT），剂量为12 Gy或0 Gy作为对照（F；n = 10）。CR表示完全缓解。

(G) 在局部放疗（LRT）后9天，通过流式细胞术确定血液中gp70特异性CD8⁺ T细胞的数量（n = 10）。

以均值作为汇总统计。通过对数秩检验（A–F）或学生的双尾非配对t检验（G）确定统计显著性。ns表示不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S1。

图3：通过mAB/IL-2治疗逆转MHC I类缺失肿瘤对多种治疗方式的抗性

(A) IL-2及其与白蛋白结合的IL-2 mRNA的示意图，包括5’端帽子结构、5’和3’非翻译区（UTR）、开放阅读框架两侧以及多腺苷酸尾巴（左图），以及与重组蛋白相比，通过mRNA传递的长效IL-2的药代动力学（右图；n = 3）。

(B 和 C) 经αTrp1（B）或αHer2（C）单克隆抗体和IL-2治疗的B16F10-B2m^-/-（B）或MC38-Her2-B2m^-/-（C）肿瘤小鼠的生存情况，或者分别使用这两种化合物（n = 10）。CR表示完全缓解。

(D) 异质性B16F10:B16F10-B2m^-/-肿瘤模型的治疗和分析方案。

(E) 接种异质性B16F10:B16F10-B2m^-/-肿瘤并接受αTrp1单克隆抗体/IL-2、αPD-1/αCTLA4组合治疗或四联治疗的小鼠的生存情况（n = 15）。

(F) 通过流式细胞术，在IFNγ体外刺激24小时后，确定达到终点标准的小鼠异质肿瘤中MHC I类+ B16F10细胞的数量（n = 3–14）。虚线代表接种时MHC I类+细胞的比例。

(G 和 H) 经αHer2单克隆抗体/IL-2、奥沙利铂（OX）或三联组合（G；n = 15）治疗的MC38-Her2-B2m^-/-肿瘤小鼠的生存情况，或经αTrp1单克隆抗体/IL-2、环磷酰胺（CP）或三联组合（H；n = 14–15）治疗的B16F10-B2m^-/-肿瘤小鼠的生存情况。所有实验中使用编码白蛋白的mRNA和同种型单克隆抗体作为对照。

均值作为汇总统计数据。误差条代表SEM。统计显著性通过对数秩检验（B, C, E, G, H）或单向ANOVA配合Dunnett’s事后检验（F）确定。ns表示不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S2和S3。

图4：IL-2在肿瘤微环境中引发与IFN相关的炎症特征标志

(A) 实验示意图，分析经αTrp1单克隆抗体和IL-2或其中任一治疗后的B16F10-B2m^-/-肿瘤。

(B 和 C) 通过流式细胞术确定的指定肿瘤浸润免疫细胞亚群中免疫细胞浸润（B）和激活标志物上调（C）（n = 7–8）。

(D) 通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）确定的不同治疗组中细胞类型簇的比例（每组n = 3汇总）。

(E) 通过定量实时PCR（qRT-PCR）确定的整个肿瘤组织中细胞因子和趋化因子表达的log2倍变化（n = 5；每行代表一个独立的肿瘤）。

(F) 通过流式细胞术确定的B16F10-B2m^-/-肿瘤细胞中PD-L1表达（n = 7–8）。

所有实验中均使用编码白蛋白的mRNA和同种型单克隆抗体作为对照。

均值作为汇总统计数据。通过Grubb’s检验移除单个异常值（B）。统计显著性通过Kruskal-Wallis检验与Dunn’s事后检验（B）或单向ANOVA与Dunnett’s事后检验（C, F）确定。ns表示不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S4。

图5：CD8⁺ T细胞和巨噬细胞在mAB/IL-2处理的小鼠中排斥MHC I类缺失肿瘤中发挥核心作用

(A–C) 用αTrp1单克隆抗体和IL-2治疗携带B16F10-B2m^-/-肿瘤的小鼠，并消耗特定免疫细胞亚群后的存活情况。对NK1.1和Ly6G（A；n = 8–15）、CD4、CSF1R和CD90.2（B；n = 10–15）或IFNα和CD8（C；n = 8–15）进行了消耗/中和单克隆抗体注射。对照组注射了无关的单克隆抗体。CR表示完全缓解。

(D) 经αTrp1单克隆抗体和IL-2联合治疗或其中任一治疗后，从B16F10-B2m^-/-肿瘤中分离出的CD8⁺ TILs中选定基因的表达情况，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）确定（每组n = 3汇总）。治疗于接种后9天开始，分析于接种后第20天进行。

(E) 用流式细胞术测量，治疗后B16F10-B2m^-/-肿瘤中渗透的巨噬细胞的M1/M2比例，治疗包括αTrp1单克隆抗体和IL-2联合或其中任一治疗处理。治疗于接种后9天开始，分析于接种后第20天进行。

(F) 热图显示了接种后第20天，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）测量的B16F10-B2m^-/-肿瘤中巨噬细胞中前20上调和前20下调基因的表达（每组n = 3汇总）。治疗于接种后9天开始，包括αTrp1单克隆抗体和IL-2 mRNA或其中任一单一化合物。

所有实验中均使用编码白蛋白的mRNA和同种型单克隆抗体作为对照。

均值作为汇总统计数据。通过Grubb’s检验移除单个异常值（E）。统计显著性通过对数秩检验（A至C）或单向ANOVA配合Dunnett’s事后检验（E）确定。ns表示不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S5和S6。

图6：IL-2激活的CD8⁺ T细胞和呈递肿瘤新抗原的巨噬细胞进行特异性交流

(A) 点图（左）和特征图（右）展示了mAB/IL-2处理的B16F10-B2m^-/-肿瘤浸润免疫细胞的所有细胞簇中Ifng表达情况，这是通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）确定的（每组n = 3汇总）。治疗在接种后9天开始，分析在接种后第20天进行。

(B) 通过流式细胞术测量，在接种后9天开始治疗并在接种后第18天进行分析的mAB/IL-2处理小鼠中，注射针对CD8或IFNγ或无关对照单克隆抗体后，B16F10-B2m^-/-肿瘤浸润巨噬细胞的M1/M2比例（n = 9–10）。

(C) 在接种后第15天进行单次αTrp1单克隆抗体和IL-2或其中任一治疗3天后，通过流式细胞术量化测定浸润B16F10-Ova-B2m^-/-肿瘤的巨噬细胞上H2-Kb/SIINFEKL复合物的数量（n = 8）。编码白蛋白的mRNA和同种型单克隆抗体作为对照。

(D) 实验示意图，分析从携带MC38-Her2-B2m^-/-肿瘤的小鼠中分离出的巨噬细胞呈递新抗原的能力，这些小鼠在接种后第20天被分析。治疗在接种后第9天开始，使用αHer2单克隆抗体和IL-2联合或其中任一种进行处理。

(E) CD8+ TILs与BMDCs单独共培养或在新抗原肽段或指定肿瘤细胞系存在下共培养的IFNγ ELISpot检测（n = 8）。

(F) 从肿瘤组织中分离出的巨噬细胞与接种空载体、Rpl18-或Adpgk编码RNA-LPX的小鼠的CD8⁺ T细胞共培养的IFNγ ELISpot检测（n = 8）。

均值作为汇总统计数据。通过Grubb’s检验移除单个异常值（B）。统计显著性通过单向ANOVA配合Dunnett’s事后检验确定。ns表示不显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。另见图S6。

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