上期内容：肿瘤免疫学-第41章 血液和肿瘤微环境的免疫监测（上）

41.4 多重免疫组织化学(IHC)检测

组织学和免疫组化（IHC）是研究各种组织中复杂生物过程的极佳工具。对于癌症患者而言，主要挑战在于理解肿瘤微环境（TME）中驱动疾病的生物学机制。基于显微镜的组织分析可以识别组织中的结构和功能分子，并确定它们在细胞内或细胞外的定位。分析可以使用新鲜冰冻（FF）或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织样本进行，关键在于样本的适当处理，以避免蛋白质和核酸损伤。为保持生物分子完整性，需要采取谨慎的处理步骤，并确保质量控制，包括验证染色是否能够正确显示目标标记。

免疫组化技术使用抗体对组织切片中的分子进行特异性标记和染色。抗体结合通过酶反应（通常在单个组织切片上标记三到四个）或荧光染料（最多标记八个）来检测。为减少后续染色中的交叉反应，常使用信号放大技术来共价连接抗体和染料。使用多光谱相机可以识别这些标记物。此外，新的技术能够通过荧光团的连续染色、扫描、移除（漂白）等循环步骤，标记更多分子（可能超过100个），不过这需要特定软件来覆盖和分析序列图像。

IHC 通常在传统的组织切片上进行，而一种替代方法是使用组织微阵列。这种方法通过将直径0.6-2 mm的组织圆柱体插入石蜡块，能够根据假设和实验设计选择特定的组织区域。利用这些组织微阵列块，可以在一个石蜡块中包含多达100名患者的组织，极大地提高了染色效率，非常适合大规模定量研究。

传统上，组织图像的分析和解释由训练有素的病理学家通过显微镜进行定性和半定量评估。然而，随着自动图像分析软件的出现，越来越多的分析过程可以被自动化，从而对大量组织区域进行完全定量的评估。尽管如此，病理学家的监督仍然是必不可少的，以确保对组织复杂性的正确解读和质量控制。

总而言之，使用高效和精准的方法对组织进行分析是研究和患者评估的核心支柱。例如，在癌症研究中，定量肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）是极为重要的，它们往往具有很高的预后和预测价值，有时甚至比传统的TNM分期（肿瘤、淋巴结、转移）更具参考意义。这些技术还允许对肿瘤细胞巢、侵袭边缘或肿瘤周围区域等定义区域中的TIL进行量化，每个区域可能具有不同的生物学意义和临床结果。

41.5 高通量技术

多种高通量技术能够同时检测数千个参数，因此广泛用于肿瘤研究中（如Fig. 41.5所示），特别是基于测序的方法。全外显子组测序（WES） 是识别肿瘤细胞基因异常的关键工具，它能够揭示特定的基因突变和总体突变负荷。当WES与DNA拷贝数分析结合时，可以提供肿瘤细胞基因变化的全面概览，揭示其是否引发了功能性变化。

另一种日益重要的技术是RNA测序（RNA-seq），它能够定量评估mRNA或microRNA的表达。这项技术广泛应用于多种研究目的，例如基因签名研究，或用于表征趋化因子、细胞因子及其他免疫因子的表达。此外，DNA甲基化图谱可用于研究调控免疫基因表达的表观遗传机制，也可以用于特定细胞谱系的表观遗传修饰，从而估算肿瘤微环境中不同细胞群体的比例。

Fig. 41.5 描绘了利用高通量技术表征癌细胞及其微环境的策略，以改善患者的诊断和治疗，推动精准医学的发展。越来越多的技术可以全面表征癌症患者的组织和细胞，从而更详细地描绘原发性肿瘤和转移性癌症的肿瘤生物学及免疫参数。

由于这些高通量技术生成的数据量巨大，数据的存储、处理、统计分析和结果解释变得非常复杂，必须依赖生物信息学工具来进行支持。这需要强大的硬件和专业知识。例如，DNA微阵列数据可以通过BRB-Array Tools进行分析，该软件为预测性分类器的开发和交叉验证提供了广泛的工具。专门的软件也被用于研究表观遗传编程，这些工具必须严格遵守数学和统计规则，例如处理多重测试时的分析原则，以及对大规模数据的统计评估。

大多数生物样本包含多种不同成分的细胞类型。例如，不同组织中的mRNA序列数据可能由于不同细胞类型的相对比例差异而混淆。因此，开发了多种去卷积算法，旨在估算样本中不同细胞群体的比例。此外，具有体细胞突变的肿瘤抗原（新抗原）可以通过多种软件工具进行预测，这些工具用于预测抗原的加工和MHC结合等因素。与常规的自身抗原相比，肿瘤特异性T细胞识别新抗原通常具有更好的疗效。

然而，必须谨慎对待这些预测，因为大多数预测的抗原可能与免疫应答无关，它们可能未被有效呈递给T细胞，或者相应的T细胞并不存在。因此，生物信息学结果始终需要与实验数据相结合，最好是在大规模数据支持下验证。

41.6 验证检测方法、临床使用的生物标志物及大数据集成

从实验室医学诞生之初，避免错误和误解，以及防止过度解读，就一直是至关重要的。随着生物医学实验室的快速发展和海量数据的产生，这一概念变得更加重要。要达到令人满意的精度和标准化水平，需要付出巨大的努力。尤其重要的是，实验结果必须对患者的健康有实际意义，而这往往只适用于一小部分数据，因为大多数数据与诊断或治疗决策几乎没有显著关联。

众多专家和广泛的文献为负责任地开发实验室方法提供了基础。例如，发表在《癌症免疫治疗杂志》上的一篇两卷本论文，深入探讨了如何验证生物标志物以预测癌症免疫治疗的反应。所有实验程序、分析和结果必须在临床前和临床上进行验证，且常规临床使用必须获得监管机构的批准。目前，只有三种检测方法已通过审批，这些方法均用于量化PD-L1表达（详见下文）。

质量标准适用于每一个步骤，从提取到处理血液和组织样本。例如，时间延迟和不利的存储条件可能会影响样本的质量。此外，现代实验室方法涉及大量变量，这些变量都需要定义和标准化，以确保在不同机构之间能够获得高度重复性的结果。同时，分布参考样品对方法开发和后续的定期测试同样重要。最后，必须通过临床研究确定临床相关性，最好是在随机前瞻性试验中，而不仅仅是回顾性研究。

已经开展了一些前瞻性研究，尤其是评估PD-L1在患者肿瘤中的表达，目的是预测抗PD-1或抗PD-L1抗体进行“检查点阻断”治疗的效果。此外，免疫组化（IHC）正在为结肠癌患者进行TIL量化的国际多中心标准化工作，这可能成为未来对更多癌症类型进行常规组织学评估的基础。这有望在不久的将来将免疫参数整合到疾病分期和治疗方案中。

然而，成功实现这一目标的关键是继续努力标准化评估方法，以便在各种临床情境中准确应用这些免疫参数，而不仅仅停留在量化TIL和PD-L1表达的初步步骤上。

除了分析产生大量数据的实验的复杂性之外，另一个巨大的挑战是将所有实验室结果与每个患者的临床信息相结合，以确保做出最佳的临床决策。为实现这一大数据集成的目标，计算技术正在快速发展，例如IBM Watson系统。目前，一个专门为癌症药物定制的版本（Watson肿瘤学）正在开发中。这类系统有巨大的潜力，但其实施依赖于紧密的多学科合作，以确保不仅采用最佳的新方法管理患者，还要考虑到所有当前的知识和质量标准。

41.7  结论

免疫监测在许多实验室中都可以进行，但其挑战在于开发和应用标准化的样本分析方法。处理细胞材料的过程非常精细，要求操作人员经过专门培训。任何对标准工作流程的轻微偏差都会显著影响样本的质量，进而影响不同技术所得结果的准确性。

为了解决这一问题，标准化的方法学和结果报告指南至关重要，这些指南有助于在不同临床试验中更好地表征和比较免疫反应。例如，生物和生物医学调查的最低信息（MIBBI）计划为实验提供了一个框架，包含了多个项目，如关于流式细胞术（Flow Cytometry，利用激光分析细胞性质的技术）的最低信息（MIFlowCyt）、关于细胞检测的最低信息（MIACA）以及关于T细胞检测的最低信息（MIA TA）。这些建议基于NCI（美国国家癌症研究所）的REMARK标准，即肿瘤标记物预后研究的报告建议。

为了确保高质量的免疫监测，多机构试验通常依赖于一个中心实验室以及大规模的临床标本库（样本储存设施），以便未来能够对血清（血液中的液体部分）、活细胞、RNA（核糖核酸，遗传信息的传递者）和DNA进行进一步分析。

临床和实验室人员必须共同努力，严格执行现有的标准，并制定更优的原则，最大限度地利用临床试验的成果，同时支持更有效治疗方法的开发。